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图1. 基因转录示意图[2]
一、检测染色质可及性的工具—ATAC-seq研究染色质可及性的传统方法有DNase-seq、MNase-seq和FAIRE-seq等，但存在灵敏度较低和样本需求量高等缺点。2013年，斯坦福大学Howard Y Chang和 William J Greenleaf教授团队开发了基于Tn5转座酶的ATAC-seq (Assay of Transposase Accessible Chromatin with High-throughput sequencing)[3]，用于测定开放染色质区域DNA序列，推断DNA结合蛋白的位点和组成，识别参与基因调控的转录因子等关键信息，其准确性与传统方法一致，但重复性更高，且只需少量细胞或组织。图片
图2. ATAC-seq技术原理（A）与步骤（B）A. 转座子只能插入开放的染色质 DNA，所以利用 Tn5 转座酶，将携带测序标签的转座复合物加入到细胞核中，后续利用标签进行 PCR 扩增，即可识别开放染色质;B.转座后成为 DNA 片段。在 72°C延长，与adapter 连接，再扩增，随后 PCR 扩增出来的序列就包含了 adapter、共有序列未端、测序标签尽管在基因组水平上的开放染色质区域检测取得巨大进步，但在蛋白质水平上，缺乏直接鉴定开放染色质区域实际结合的转录调控复合物。
●技术应用
1. 初步判断所研究的课题是否涉及表观遗传调控机制
2. 结合基序分析，识别参与基因调控的转录因子
3. 与超级增强子鉴定联合分析，明确活性超级增强子的范围
4. 更好地了解药物或疾病的基因调控和细胞应答机制
5. 识别驱动细胞命运、疾病或应答相关的转录因子
●技术优势1. 灵敏性高，低细胞起始量，每个样本 50,000 个细胞即可2. 实验步骤简化，实验重复性好，成功率高3. 能同时揭示开放染色质的基因组位置、DNA 结合蛋白和转录结合位点的相互作用图片
二、复旦大学团队首次实现了开放染色质区域转录蛋白机器的鉴定及功能研究—ATAC-MS
复旦大学贺福初/丁琛团队于2021年在《SCIENCE ADVANCES》上发表题为“Proteome-wide profiling of transcriptional machinery on accessible chromatin with biotinylated transposons”的研究论文[4]，该研究成果首次实现了开放染色质区域转录调控蛋白机器的鉴定及功能研究，为基因转录调控研究提供了强大的技术支撑。
研究团队基于ATAC-seq技术开发了一种直接富集和定量鉴定内源性开放染色质区域实时原位转录的转录调控蛋白机器的新技术“ATAC-MS”（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using Mass Spectrum）。
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图3. ATAC-MS技术原理。该技术通过生物素修饰接头的高活性Tn5转座酶插入开放染色质区域上DNA，用链霉亲和素偶联的磁珠与生物素化的DNA反应，富集DNA及DNA上结合的转录蛋白复合物，对复合物分别进行蛋白质酶解-肽段纯化与DNA文库制备构建，可并行ATAC-MS和ATAC-seq，获取结合的转录调控复合物和开放染色质区域基因组信息通过ATAC-MS描绘四种细胞系中转录调控网络，结果表明ATAC-MS可直接鉴定开放染色质区域结合蛋白的优势。且ATAC-MS在使用5×105细胞量时，即可检测到高丰度的转录因子/转录辅助因子。
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图4. ATAC-MS和ATAC-seq整合分析。富集通路（上）；TF motifs序列（中）；转录调控网络（下）图片
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图5. ATAC-MS对TF/TC的检测灵敏度
ATAC-MS中的蛋白相分离步骤有效降低了非特异性结合蛋白的干扰，同时富集了转录调控相关的蛋白复合物，从而提高了TF/TC检测的定量准确性。更好地反映了细胞信号响应过程中转录调控网络的动态变化。
通过肿瘤坏死因子（TNF-α）处理Hela细胞后，利用ATAC-MS成功鉴定到关键TF家族（如NF-κB、JUN）及其相互作用的TF的动态变化。其中ATAC-MS和ATAC-seq鉴定的TF的关联分析，进一步验证NF-κB通路的激活。
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图6. NF-κB信号通路激活过程，显示TF/TC的变化趋势
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图7. ATAC-MS和ATAC-seq整合分析研究团队进一步将ATAC-MS与强阴离子交换技术结合，开发出高分辨率的fATAC-MS（ATAC-MS coupled with SAX fractionation），该技术通过盐溶液梯度洗脱DNA-转录蛋白复合物，绘制出更高分辨率的DNA-转录调控复合物图谱。研究结果显示，该技术能识别不同组分中的关键调控因子及其DNA结合模式，验证了其在全基因组范围内解析DNA-蛋白质互作关系的潜力。
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图8. fATAC-MS流程
此外，研究团队还将ATAC-MS与CRISPR/Cas9技术进行结合，开发了具有靶向性的ctATAC-MS（dCas9-targeted ATAC-MS），设计并表达了一种新Tn5-dCas9融合蛋白，既具有Tn5转座酶结合开放染色质的功能，检测基因组水平的转录调控复合物，又可在sgRNA的引导下对特定的DNA序列具有亲和力，精准鉴定特定位点的转录调控复合物。ctATAC-MS系统地描述了在小鼠肝脏昼夜节律模型中靶向E-box的转录过程，揭示了不同TFs在昼夜节律中的潜在机制。
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图9. ctATAC-MS的技术原理
综上，贺福初/丁琛团队的这项研究成果展示了全新的转录调控复合物解析工具包“ATAC-MS、fATAC-MS和ctATAC-MS”，可全面解析全基因组水平的转录调控复合物图谱，也可鉴定特定基因组位点的转录蛋白复合物。这项研究成果将推动相关邻域科研人员深入研究不同层面的转录调控机制。
●技术应用
1. 结合ATAC-seq分析，识别细胞特异性的转录调控网络
2. 研究转录因子和共调节因子结合到开放染色质区域的动态变化
3. 通过质谱对结合在开放染色质区域上的转录蛋白复合物进行鉴定和定量
4. fATAC-MS提供高分辨率的染色质-转录蛋白图谱
5. ctATAC-MS精准定位特定开放染色质区域的转录机制
6. 识别与疾病或通路相关的转录因子
●技术优势
1. 与ATAC-seq联合分析，全面解析DNA-转录蛋白机制
2. 可直接鉴定转录蛋白复合物
3. 对低丰度的转录因子具有高灵敏度
4. 同时获取开放染色质的基因组位置、DNA结合蛋白和转录复合位点的相互作用信息
三、清华大学团队开发了检测染色质结合凝聚体的技术—ACC-seq
清华大学李寅青/李丕龙团队于2024年4月16日在《Cell》上发表题为“Dual-Role Transcription Factors Stabilize Intermediate Expression Levels”的研究论文[5]，研究团队开发了一种可在全基因组范围内检测染色质结合凝聚体的技术—ACC-seq（Assay for Chromatin-bound Condensates by exploratory Sequencing），并利用该工具揭示了一类具有相分离能力的双重作用转录因子（dual-action TFs）。它们能抑制基因高表达的同时激活沉默基因，通过形成凝聚体调节基因表达的中间水平。
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图10. ACC-seq研究成果总概
ACC-seq是利用Tn5转座酶在不同凝聚体调节条件下对DNA片段的可及性差异来识别凝聚体占位区域。三个核心步骤为使用不同的处理方式调节染色质凝聚体状态：
①Native：不做任何处理，保持细胞内凝聚体的自然状态；②Fix：使用甲醛固定细胞，将凝聚体与其结合的DNA交联固定；③1,6-Hex Fix：先使用1，6-己二醇处理细胞，破坏凝聚体结构并释放其结合的DNA，然后再进行固定。对这三种不同处理方式处理的样本分别使用Tn5转座酶进行切割。由于凝聚体会阻碍Tn5转座酶对DNA的切割，因此再凝聚体占位区域，Fix样本的DNA可及性会降低，而1,6-Hex Fix样本的DNA可及性会恢复。最后对切割后的DNA片段进行高通量测序。
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图11. ACC-seq技术原理
利用ACC-seq验证了FUS(IDR)-SOX2的DNA结合域融合的蛋白在形成凝聚体中的功能，并通过FRAP（光漂白荧光恢复技术）呈现这些凝聚体的动态特性。
研究团队运用ACC-seq在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中鉴定出一类具有相分离能力的转录因子，即凝聚体形成的双重作用转录因子（condensate-forming dual-action TFs），当这些dual-action TFs发生相分离时，与转录的不同组分具有显著差异的亲和性，这种差异性亲和性驱使dual-action TFs在调控基因表达水平上具有激活和抑制的双重功能，抑制基因高表达的同时激活沉默基因，有效地将基因表达水平调节到一个中间水平。
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图12. 基因表达调控实验示意图
研究团队进一步研究，明确了dual-action TFs的双重作用与其相分离能力有关，dual-action TFs的内在无序区域（IDR）包含多个功能序列单元，能够独立发挥激活或抑制作用。ETV5是唯一在IDR中同时含有激活和抑制单元的转录因子。破坏IDR会导致dual-action TFs在凝聚体中与MED1的亲和性改变，并失去双重作用。而将dual-action TFs与亲水的MBP肽段融合，使这些蛋白的相分离能力受到干扰，双效转录调控功能也会受到显著影响。
最后，研究团队发现dual-action TFs在mESCs中调控一系列与发育相关的基因，这些基因在mESCs中以中等水平表达。进一步通过过表达和敲低实验，发现在转录因子水平发生变化时，也能维持靶基因的稳定表达。作者利用scRNA-seq数据进行分析，发现dual-action TFs的靶基因在干细胞状态下表达水平较低，而在mESCs分化过程中则被上调。总之，这些研究结果表明dual-action TFs在维持干细胞功能和促进细胞分化方面发挥重要作用。
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图13. dual-action TFs通过差异分子间相互作用的凝聚体形成结构域发挥稳定的中级转录调控作用的模型
●技术应用1.全基因组范围内识别染色质结合凝聚体的占位区域2.研究染色质结合凝聚体对基因表达的影响3.结合其他测序和成像技术，研究凝聚体形成TFs的特性和功能4.分析与疾病相关的TF变异对凝聚体形成和转录调控的影响5.发现并表征新的染色质结合凝聚体●技术优势1.可以检测到由少量TF分子形成的小凝聚体2.实验流程相对简单，易于操作3.能够提供凝聚体形成TF的结合位点、表达水平和功能信息四、多种技术比对
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图14. 多种技术对比[6,7]（仅供参考）
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图15. 开放染色质经典检测技术对比[8]
五、技术应用
1.应用方向一：基因调控（ATAC-seq ATAC-MS）
ATAC-seq可指导ATAC-MS，找到感兴趣的开放染色质区域，ATAC-MS则可验证ATAC-seq预测的转录因子，并进一步描绘转录调控蛋白复合物的组成。ATAC-seq和ATAC-MS整合分析可在全基因组范围描绘出转录调控复合物图谱，包括转录因子结合位点，以及这些转录因子是如何组装成转录调控复合物的（图3、图6），包括能够可构建详细的转录网络图，揭示在细胞过程中不同转录因子和共调控因子如何相互作用和共同发挥功能。深入解析不同层次的转录调控机制。
另外开发的fATAC-MS可以对开放染色质进行分级分析，获得不用层次的转录调控复合物信息，通过fATAC-MS将开放染色质区域细分，再结合ATAC-seq，可以描绘出更高分辨率的转录调控复合物图谱。
此外，ctATAC-MS可以针对感兴趣的特定基因组区域进行精准分析。与ATAC-seq结合，ctATAC-MS可以深入探究特定基因或调控元件周围的转录调控复合物组成和动态变化。
（1）研究案例
在复旦大学贺福初/丁琛团队发表的研究成果“Proteome-wide profiling of transcriptional machinery on accessible chromatin with biotinylated transposons”中[4]，研究团队使用配体调节的TF ERα（ESR1）在MCF7细胞中通过ATAC-MS研究TF-TC复合物。研究综合ATAC-MS和ATAC-seq的分析揭示了潜在的ESR1中心的TF/TC-TG网络，将ATAC-seq识别到的Motifs与ATAC-MS鉴定到的TFs/TCs进行了关联分析等。使用17β-雌二醇（17-estradiol，E2）与4-羟基他莫昔芬（4-hydroxytamoxifen，4-HT）处理MCF7细胞，结果显著富集了与E2响应性ESR1激活或失活相关的通路，可发现E2处理显著上调了转录共激活因子，而在4-HT处理下，也富集了转录共抑制因子，证实了对TC的高富集是ATAC-MS的优势。
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图16. ATAC-MS和ATAC-seq结果的整合揭示了E2或4-HT处理后的转录机制
研究团队将开发的ATAC-MS应用于C2C12细胞分化过程中的转录调控机制的研究，结合ATAC-seq、ChIP-seq等方法的验证，揭示了RFX1（调控因子X1）可调节C2C12细胞的增殖和分化。
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图17. ATAC-MS和ATAC-seq结果的整合揭示了C2C12成肌细胞分化过程中的转录机制
（2）研究思路
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2.应用方向二：相分离（ACC-seq ATAC-MS）
ACC-seq协同ATAC-MS进行应用，ACC-seq识别染色质结合凝聚体的区域，而ATAC-MS可以鉴定凝聚体中的蛋白质成分，并筛选出潜在的凝聚体形成转录因子；利用ACC-seq识别受凝聚体形成TF调控的基因，并分析其表达水平的变化，
然后利用ATAC-MS鉴定与这些TF相互作用的蛋白，包括共激活因子和共抑制因子，结合qPCR、WB等实验方法，验证这些TF的双重功能和差异相互作用；还可以利用ACC-seq和ATAC-MS分析不同细胞类型、发育阶段或疾病状态下凝聚体形成TF的结合和表达变化，结合基因敲除、过表达等实验方法，研究这些TF对细胞命运、发育或疾病进程的影响。总之，通过比较ACC-seq和ATAC-MS在不同条件下的结果，可以研究凝聚体的动态变化及其对转录机器的影响。
（1）研究案例
同样基于ATAC-seq开发的新工具ACC-seq，具有一定的应用潜力。这个研究成果“Dual-Role Transcription Factors Stabilize Intermediate Expression Levels”[5]利用开发的ACC-seq比较ATAC-seq在Native、Fix和1,6-Hex Fix条件下的染色质可及性模式，推断染色质结合凝聚体的存在。特别是在1,6-Hex Fix条件下，ACC-seq能够恢复DNA可及性，从而生成高水平的可扩增ATAC-seq片段。
该研究利用ATAC-seq和RNA-seq数据分析了ACC-seq簇与转录的关系，发现hex-released可及区域与中等表达水平的基因相关。
通过ACC-seq发现了一类新的dual-action TFs，它们能够通过形成凝聚体来选择性地调节调节基因表达。图片
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图18. ACC-seq不同实验条件下的DNA可及性模式变化图片
图19. ACC-seq与RNA-seq、GRO-seq对比的IGV峰图
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图20. A）ACC-seq簇的可及性水平；B）基因近端和基因远端调控区的ACC-seq的peaks图片
图21. hex-released开放性区域TF motifs富集(左)；预测的IDR75和疏水残基(右)总之，ACC-seq是对ATAC-seq的一种特殊应用，它增加了对染色质环境的解析维度。ACC-seq和ATAC-MS的联合也具有可观的应用潜力，特别是相分离领域，可以把相关的蛋白反向分析出来，用于发现耐药相关靶点，识别与耐药性相关的TFs/TCs和凝聚体，揭示耐药机制；筛选靶向耐药相关凝聚体或 TFs/TCs 的药物。用于研究衰老相关靶点，揭示衰老过程中染色质可及性和转录机器的变化，寻找延缓衰老的靶点；研究与衰老相关的凝聚体，例如异染色质凝聚体。还可用于研究癌症、神经退行性疾病等方面的研究。
（2）研究思路
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3.应用方向三：表观基因组（ATAC-seq CUT&Tag）
CUT&Tag，即靶向剪切及转座酶技术，利用酶锚定技术绘制蛋白质-DNA互作图谱，和ChIP-seq一样使用抗体特异性结合目的蛋白，但不需要甲醛交联和免疫共沉淀，因而所需细胞量少，信比高。利用ATAC-seq识别全基因组范围内的开放染色质区域，然后通过CUT&Tag分析目标蛋白（如特定转录因子或带有特定修饰的组蛋白）在基因组中的结合位点，整合两种数据，筛选出目标蛋白特异性结合的开放染色质区域，这些区域可能具有重要的转录调控功能；可以揭示开放染色质区域的表观遗传特征（如特定修饰的富集模式，以及其与基因表达的关系）；也可以利用ATAC-seq和CUT&Tag分析不同细胞类型或疾病状态下开放染色质区域和目标蛋白结合的变化，通过差异分析揭示关键的转录因子和表观遗传修饰。
（1）研究案例
2024年7月15日，北京协和医院赵玉沛/由磊团队在《Cancer Letters》杂志上发表了题为“Histone lactylation dynamics: Unlocking the triad of metabolism, epigenetics, and immune regulation in metastatic cascade of pancreatic cancer”的研究论文[9]。这项研究通过scRNA-seq、ATAC-seq和CUT&Tag等多组学技术研究了组蛋白乳酸化在胰腺癌转移过程中对代谢-表观遗传-免疫调节的影响，发现LDHA-H4K12la免疫基因轴在代谢、表观遗传学和免疫之间建立了新的调控节点，揭示了组蛋白乳酸化与免疫逃逸和肿瘤进展之间的关系，强调了其作为潜在治疗靶点的重要性。
这项研究深入探讨了LDHA（乳酸脱氢酶A）对癌症进展的影响，尤其关注组蛋白乳酸化（H4K12la）的作用。考虑到H4K12la与糖酵解的密切相关性及其在转录激活中的关键角色，研究重点转向H4K12la的功能。
研究使用CUT&Tag检测组蛋白修饰，分析LDHi（LDHA抑制剂）处理前后H4K12la富集的变化，发现H4K12la的表达显著减少，主要集中在启动子区域，
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图22. LDHi 处理前后 H4K12la 富集的变化
考虑到组蛋白乳酸化对核小体构型和染色质可及性的未知影响，研究团队又利用ATAC-seq分析LDHi处理前后胰腺癌细胞中开放染色质区域的变化，结果显示LDHi 导致开放染色质区域密度降低，同样是主要集中在启动子区域。
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图23. I）CUT&Tag和ATAC-seq检测结果在基因功能元件上的分布；J）Peaks的元基因图谱和 TSS 热图表明，H4K12la 和 ATAC 主要靶向启动子
GO富集分析结果表明ATAC-seq和H4K12la CUT&Tag的peaks主要集中在代谢调控、表观遗传机制、免疫特征及肿瘤相关恶性表型的转移和增殖等四大类。基因集富集分析揭示了与转录、物质代谢及Wnt和Notch信号通路相关的功能。
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图24. G-H）ATAC-seq和H4K12la CUT&Tag的peaks的GO富集分析；K-L）对启动子可及或富集 H4K12la 的 PBS 特定motifs进行鉴定和功能富集分析
GO富集分析显示，ATAC和H4K12la CUT&Tag的独特峰主要集中在代谢调控、表观遗传机制、免疫特征及肿瘤相关恶性表型的迁移和增殖等四大类。基因集富集分析揭示了与转录、物质代谢及Wnt和Notch信号通路相关的功能。
通过motif 分析，作者预测了参与 H4K12la 调控的转录因子，并构建了一个包含免疫相关基因和转录因子的网络，为增强免疫监视和免疫治疗效果提供了潜在的治疗靶点。
在这项研究中，也可以考虑使用ATAC-MS技术，用于分析组蛋白乳酸化对特定基因的转录活性和染色质可及性的影响、可辅助描绘肿瘤微环境中不同细胞类型或肿瘤细胞中免疫逃逸相关基因的开放染色质状态、还可用于解析与代谢相关的基因在乳酸状态下的染色质重塑。
（2）研究思路
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应用场景方向：
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六、总结
本文围绕开放染色技术进行介绍，从经典的ATAC-seq到基于该技术开发的ATAC-MS和ACC-seq，这些技术均推动了我们对开放染色质区域的解析，可以助力科研人员全面理解疾病相关基因的转录调控机制；高效筛选出疾病相关的关键转录因子；这些关键转录因子为疾病发生机理的研究和新型治疗靶点的发现提供的重要的技术支撑。除此之外，还有更多可扩展的研究，这些技术的应用价值远远超出基因组层面。与其他组学技术，如CUT&Tag、RNA-seq、ChIP-seq等联用，可以多维度、多层次地解析复杂的生物学过程，例如基因调控网络、相分离现象、表观遗传调控等。这些对人类疾病的精准医疗具有重要意义。
参考文献
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